PCR 擴(kuò)增 DNA 是實(shí)驗(yàn)室中常用的基礎(chǔ)技術(shù)，隨著技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展，包括臨床檢測(cè)。定量 PCR (qPCR) 是一種可靠的已建立的方法，允許對(duì)靶 DNA 進(jìn)行相對(duì)定量，例如基于 PCR 的冠狀病毒測(cè)試使用 qPCR。相比之下，數(shù)字 PCR (dPCR) 或液滴數(shù)字 PCR (ddPCR) 使用類似的化學(xué)方法檢測(cè) DNA 序列，但在許多微小體積或液滴中進(jìn)行檢測(cè)，利用數(shù)學(xué)的力量提高信噪比。
雖然 qPCR 和 dPCR 有很多相似之處和不同之處，但在與 PCR 專家交談時(shí)，有幾個(gè)重要的品質(zhì)更加突出。隨著時(shí)間的推移，PCR 技術(shù)在不斷發(fā)展，因此這些品質(zhì)也可能會(huì)隨之改變。本文旨在討論當(dāng)今 qPCR 和 dPCR 技術(shù)之間的一些重要區(qū)別，以及它們?cè)诓煌I(lǐng)域的最佳應(yīng)用。
01
靈敏度，以及絕對(duì)與相對(duì)定量
多年來(lái)，定量 PCR 一直是許多應(yīng)用的黃金標(biāo)準(zhǔn)。然而，dPCR 能夠提供更靈敏的測(cè)量和目標(biāo) DNA 的絕對(duì)定量（相對(duì)于 qPCR 的相對(duì)定量）。"使用 qPCR，科學(xué)家只能通過(guò)將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來(lái)確定樣本中的核酸濃度，"生物制藥部門(mén)經(jīng)理 Marwan Alsarraj 解釋道。"另一方面，ddPCR 直接量化核酸，因此對(duì)小核酸濃度更敏感，使工具更準(zhǔn)確。"
這使得 dPCR 非常適合于目標(biāo)存在于復(fù)雜樣本中的應(yīng)用，例如分析來(lái)自液體活檢的循環(huán)腫瘤 DNA。"隨著目標(biāo)分子變得越來(lái)越少，檢測(cè)和精確量化這些分子變得越來(lái)越具有挑戰(zhàn)性，" dPCR 高級(jí)總監(jiān)兼總經(jīng)理 Paul Hung 說(shuō)道。"由于 dPCR 自然稀釋了許多反應(yīng)中的分子，因此當(dāng)給定目標(biāo)存在于高濃度的非目標(biāo)分子中時(shí)，可以提高靈敏度。"盡管如此，qPCR 仍然是許多應(yīng)用的首選方法，因?yàn)槠渌俣雀欤子谑褂茫⑶铱梢栽诟蟮臉颖炯羞M(jìn)行相對(duì)定量。
02
在實(shí)驗(yàn)室和診所中越來(lái)越多地使用 dPCR
dPCR 的靈敏度提高使得研究實(shí)驗(yàn)室和診所都受益。“隨著細(xì)胞和基因治療研究和開(kāi)發(fā)的不斷發(fā)展，開(kāi)發(fā)人員越來(lái)越多地轉(zhuǎn)向 dPCR 來(lái)精確測(cè)量不同的目標(biāo)，包括工程病毒載體、基因編輯事件、質(zhì)粒和完整衣殼，”P(pán)aul Hung 表示。
在臨床領(lǐng)域，如腫瘤學(xué)和器官移植等方面，dPCR 檢測(cè)稀有 DNA 的能力以及量化稀有 DNA 中微小但有顯著的倍數(shù)變化，也受到了青睞。例如，dPCR 被用于檢測(cè)癌癥患者的循環(huán)腫瘤 DNA，并評(píng)估細(xì)胞和基因治療的正確劑量。“隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)變得越來(lái)越主流，我們預(yù)計(jì) ddPCR 將在臨床中變得更加普遍，因?yàn)?ddPCR 可以檢測(cè)腫瘤負(fù)荷響應(yīng)癌癥治療的微小變化，”Marwan Alsarraj 表示。“例如，使用 ddPCR 進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)可以使腫瘤學(xué)家識(shí)別治療后有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的患者。”然而，在某些情況下，qPCR仍然是臨床應(yīng)用的首選方法，因?yàn)樗焖伲子谑褂茫⑶铱梢栽诟蟮臉颖炯羞M(jìn)行相對(duì)定量。
03
動(dòng)態(tài)范圍和靈活性
盡管 dPCR 在靈敏度方面表現(xiàn)出色，但在許多其他應(yīng)用中，qPCR 仍然是最佳選擇。"我們建議我們的客戶在基因表達(dá)中使用 qPCR，因?yàn)樗膭?dòng)態(tài)范圍很廣；其量化不同表達(dá)水平、區(qū)分剪接變體和多重分析的能力；及其高通量應(yīng)用和自動(dòng)化的能力，" Marwan Alsarraj 表示。實(shí)際上，在實(shí)驗(yàn)室和監(jiān)管環(huán)境中，qPCR 更為廣泛應(yīng)用，并且被廣泛用于基因、健康狀況或傳染病的篩查。
在分析大量樣本時(shí)，qPCR 可能比 dPCR 更為經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。"qPCR 本質(zhì)上是一種靈活且具有成本效益的技術(shù)，可滿足許多研究需求，使研究人員能夠選擇適合其特定需求的耗材，包括多種反應(yīng)化學(xué)、分析選項(xiàng)和易于互換的塑料，" Paul Hung 表示。"在生物制藥行業(yè)，qPCR 被用于單克隆抗體、疫苗、細(xì)胞和基因治療以及生物仿制藥的制造過(guò)程中，作為質(zhì)量控制和基因分析的工具。"
隨著不斷的創(chuàng)新和廣泛的使用，qPCR 的應(yīng)用只會(huì)擴(kuò)大。"科學(xué)家們不斷發(fā)現(xiàn)使用 qPCR 的新方法，因?yàn)樗呀?jīng)從基因表達(dá)擴(kuò)展到制造和診斷的過(guò)程測(cè)試，"Alsarraj 表示。"我們希望隨著技術(shù)核心應(yīng)用的成熟，創(chuàng)新將繼續(xù)下去。"
04
多重應(yīng)用的進(jìn)展
盡管 qPCR 曾經(jīng)在多重檢測(cè)方面具有優(yōu)勢(shì)，但數(shù)字 PCR（dPCR）正在迅速成為發(fā)展更高的多重檢測(cè)功能的平臺(tái)。例如，Stilla Technologies 的 naica ®系統(tǒng)等平臺(tái)可以運(yùn)行 30 重或更多的 dPCR 反應(yīng)。“一些客戶可以在 naica ®系統(tǒng)上運(yùn)行與在 qPCR 儀器上相同的分析，但他們只運(yùn)行一次樣品并獲得絕對(duì)定量，而不是依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線并不得不重復(fù)運(yùn)行他們的樣品，”Stilla Technologies 全球營(yíng)銷和商業(yè)運(yùn)營(yíng)副總裁 Matthew Grow 表示。“在 naica ®系統(tǒng)為研究人員提供了查看擴(kuò)增和檢測(cè)效率的能力，一直到單個(gè)液滴的水平，每個(gè) PCR 反應(yīng)在他們珍貴的樣本中并行發(fā)生。”
隨著 dPCR 能夠檢測(cè)稀有基因表達(dá)或癌癥相關(guān)的拷貝數(shù)變異事件，更多的多路復(fù)用可能會(huì)揭示更多未來(lái)使用的途徑。“多重 dPCR 是對(duì)當(dāng)前下一代測(cè)序技術(shù)的出色補(bǔ)充，可以讓醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室有機(jī)會(huì)進(jìn)行更多的內(nèi)部患者檢測(cè)，而不必與外包或集中式實(shí)驗(yàn)室合作，”Matthew Grow 指出。
盡管如此，qPCR 和 dPCR 可能會(huì)繼續(xù)以互補(bǔ)關(guān)系存在。“我們已經(jīng)看到 qPCR 對(duì)于監(jiān)測(cè)和管理 COVID-19 大流行的重要性，它將仍然是臨床測(cè)試實(shí)驗(yàn)室、分析開(kāi)發(fā)人員和生物技術(shù)行業(yè)的重要工具，”P(pán)aul Hung 表示。“隨著 dPCR 技術(shù)通過(guò)簡(jiǎn)化的工作流程和更快的回答時(shí)間變得更容易獲得，它將在需要穩(wěn)健、可靠和精確量化的用例中得到采用。因此，兩種技術(shù)將繼續(xù)在不同的應(yīng)用場(chǎng)景中發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)。”
2023-9-8 |
